加味芍药甘草汤对人子宫腺肌病细胞MAPK信号通路干预及临床研究

【摘要】目的：1、介绍导师治疗子宫腺肌病的学术思想和临证经验,总结其用药规律以及临证化裁。2、观察不同浓度加味芍药甘草汤对人子宫腺肌病病灶细胞上清液雌二醇、细胞雌激素受体、芳香化酶P450、MAPK信号通路因子(Ras、Raf、MEK-2、ERK1、ERK2)、细胞核内转录因子(NF-kB、c-Fos、c-Jun)、细胞超微结构、细胞凋亡率的变化,阐明中药复方加味芍药甘草汤干预子宫腺肌病痛经的深层作用机理,为临床辨证用药奠定基础。方法：1、通过多种途径全面系统收集、仔细阅读李坤寅教授多年来发表的及未发表的论文、专著、讲稿、临证体会,以及跟诊过程中收集李教授的临床经验及行之有效的遣方用药,分析、总结李坤寅教授治疗子宫腺肌病的学术思想、辨证思路及用药规律。2、采用透射电镜、流式细胞技术、酶联免疫吸附法、免疫细胞化学法、荧光定量PCR(探针法)、免疫蛋白印迹法检测不同浓度加味芍药甘草汤对人子宫腺肌病病灶细胞超微结构、细胞凋亡率、细胞上清液雌二醇、细胞芳香化酶、雌激素受体、MAPK信号通路因子(Ras、Raf、MEK-2、ERK1、ERK2)、细胞核内转录因子(NF-kB、c-Fos、c-Jun)。并以空白培养液和米非司酮作为对照组。结果：1、导师李坤寅教授治疗子宫腺肌病学术思想可概括成6点：明确病机,辨病辨证,确立治法；经前经后,止痛调经,分而治之；治病与调经助孕结合；内外结合,多途径治疗；情志疏导与饮食调控结合。临证应用在此基础上各有发挥：月经前在使用“化瘀止痛方”的基础上,针对不同患者的特质配合不同的活血化瘀法加以化裁；经后重在补肾活血,扶正祛邪,调经助孕；复方毛冬青灌肠液保留灌肠及加味双柏油膏配合红外线灯热敷下腹部,清热解毒兼活血化瘀行气。除了配合使用疏肝解郁中药外,导师临证时重视心理治疗,给患者做思想工作,并建议患者少食含激素类高的食物,结合饮食调控疾病。在“化瘀止痛方”前期研究的基础上,进一步优化组成“加味芍药甘草汤”。2、加味芍药甘草汤对细胞超微结构的影响：空白对照组：核仁较大,核中常染色质较多,粗面内质网增多、扩张,线粒体较多；米非司酮组：细胞核呈圆形,核中常染色质较多,核仁靠近胞核,胞浆中线粒体形状不规则,部分发生了空泡变,溶酶体较多,内质网增多、扩张；加味芍药甘草汤高浓度组：细胞核见分叶,染色质浓缩边集,核仁缩小,胞浆中见大量溶酶体,胞质内细胞器减少,内质网轻微扩张,线粒体发生了明显的空泡变,粗面内质网减少；加味芍药甘草汤中浓度组：细胞核中常染色质较多,核近似椭圆形,溶酶体较多,线粒体轻微肿胀空泡变,内质网轻微的扩张；加味芍药甘草汤低浓度组：核中常染色质较多,核近圆形,胞浆中可见溶酶体聚集在一侧,有较多脂滴,内质网有些轻微的扩张。3、加味芍药甘草汤对细胞凋亡率的影响：米非司酮与中药各浓度组都能显著提高细胞凋亡率(P<0.05),其中米非司酮与加味芍药甘草汤高浓度组相比无显著性差异(P>0.05),米非司酮、加味芍药甘草汤高浓度组与加味芍药甘草汤中、低浓度组相比有显著性差异(P<0.05),提示加味芍药甘草汤提高人子宫腺肌病细胞凋亡率成浓度依赖性4、加味芍药甘草汤对细胞E2、芳香化酶、ER的影响：米非司酮和加味芍药甘草汤高浓度组与空白对照组相比都能显著降低细胞上清E2水平(P<0.05),米非司酮组与加味芍药甘草汤高浓度组相比无明显差异(P>0.05)；米非司酮E2水平表达显著低于加味芍药甘草汤中、低浓度组(P<0.05),加味芍药甘草汤高浓度组E2表达显著低于加味芍药甘草汤低浓度组(P<0.05)。加味芍药甘草汤高、中、低浓度组与空白对照组相比都能显著抑制芳香化酶P450表达(P<0.05),但各组之间相比无显著性差异(P>0.05)。加味芍药甘草汤高、中、低浓度组与空白对照组相比都能显著降低细胞ER水平(P<0.05),但各组之间相比无显著性差异(P>0.05)。5、加味芍药甘草汤对MAPK信号通路因子(Ras、Raf、MEK-2、ERK1、ERK2)的影响：加味芍药甘草汤各浓度组和米非司酮不能显著改变MAPK信号通路因子(Ras、Raf、MEK-2、ERK1、ERK2)的变化(P>0.05)。6、加味芍药甘草汤对细胞核内转录因子(NF-kB、c-Fos、c-Jun)的影响：米非司酮和加味芍药甘草汤各浓度组都能显著抑制NF-kB、c-Fos、c-Jun表达(P<0.05),其中加味芍药甘草汤高浓度组抑制能力最强(P<0.05),存在明显的浓度依赖性。结论：1、导师李坤寅教授治疗子宫腺肌病注重辨病辨证,兼顾患者生育要求,根据月经周期不同规律分期治疗,通过多途径治疗、情志疏导结合饮食调控疾病。在“化瘀止痛方”前期研究的基础上,进一步优化组成“加味芍药甘草汤”。2、加味芍药甘草汤可能通过改变细胞器结构,使溶酶体增多,染色质浓缩边集以提高细胞凋亡率,从而抑制子宫腺肌病病灶增殖,促进子宫腺肌病病灶萎缩。3、加味芍药甘草汤通过抑制ER表达从而降低E2与ER结合率,E2生物学效应降低,可阻断或减少了异位病灶组织在肌层内种植、生长；另外加味芍药甘草汤通过抑制芳香化酶以阻断与病灶局部E2正反馈循环,从而降低病灶局部细胞分泌E2含量,一则雌激素对子宫收缩的调节作用减少,子宫收缩性减弱,从而缓解或消除痛经；二则雌激素对异位内膜的生物学信号减少,同样也阻断或减少了异位内膜在肌层继续增殖、生长。4、加味芍药甘草汤有可能只是改变了子宫腺肌病细胞中Ras、Raf、MEK-2、ERK1、ERK2磷酸化活性,没有改变各因子的表达数量。5、加味芍药甘草汤通过抑制NF-kB、c-Fos、c-Jun表达,降低子宫腺肌病病灶细胞的异常增殖,阻碍了子宫腺肌病的发展,这一效应可能通过降低雌激素与雌激素受体的结合,抑制雌激素经典基因转录效应实现。
【作者】凌静；
【导师】李坤寅；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医妇科学（专业学位），2014，博士
【关键词】子宫腺肌病；原代细胞培养；加味芍药甘草汤；雌激素；MAPK信号通路；

【参考文献】
[1]高航.永宁油田双河东区长6_2储层特征及剩余油分布规律研究[D].西北大学,矿产普查与勘探,2014,硕士.
[2]马强明.基于多Agent的协作供应链管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[3]汪雅芸.大学英语多媒体教学对言语—表象型认知风格的影响[D].湖北大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[4]汪和平.我国民事上诉审制度之研究[D].安徽大学,法律,2003,硕士.
[5]张凡.家庭德育对高中生思想品德的影响研究[D].苏州大学,学科教学,2012,硕士.
[6]卢兆大.一种全功能单芯片荧光灯电子镇流器的设计[D].上海交通大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[7]王晓红.基于时态数据模型的人力资源管理系统[D].广东工业大学,2004.
[8]谭志中,陆建隆.多边形电阻网络等效电阻的统一建构[J].河北师范大学学报(自然科学版),2011,02:140-144.
[9]王媛媛.阿什河阿城段分散点源污染分析与污染防控对策研究[D].哈尔滨工业大学,环境工程,2014,硕士.
[10]骆健,庄林,郑彦.大客户管理系统的设计与实现[J].山东电子,2004,02:63-64.
[11]郭清茹.水泥路面加铺沥青面层施工工艺研究[D].吉林大学,建筑与土木工程,2012,硕士.
[12]刘波.水平荷载作用下群桩的受力机理研究[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2004,硕士.
[13]雷勇.仪表图像信息采集处理方法的研究[D].大连海事大学,交通信息工程及控制,2004,硕士.
[14]王艳杰.论《美丽曲线》中同性恋者的审美化生存及困境[D].首都师范大学,比较文学与世界文学,2014,硕士.
[15]杜天军,陈光(?),谢永乐.利用内插优化技术解决谐波检测小波混叠[J].电力系统自动化,2005,05:62-68.
[16]戴培山,王博亮,鞠颖.视网膜血管图像分割及眼底血管三维重建[J].自动化学报,2009,09:1168-1176.
[17]吴佳苹.针刺调任通督法对脑梗死恢复期疗效及TCD相关性研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[18]宋亚维.民用航空地面设施维修人员定岗定员问题研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[19]柳国城.无功电流补偿微机控制器[J].一重技术.1994(01)
[20]薛林平,周詹妮,郑钰鋆.北京密云县古北口历史文化名镇研究[J].北京规划建设,2014,04:112-120.
[21]刘蕾.半岩半土隧道结构稳定性研究[D].江苏科技大学,结构工程,2014,硕士.
[22]史晓波,雷宇虹.以深层防御战略构造信息安全体系——说科技日报社网络安全的建设[J].中国传媒科技.2003(04)
[23]胡顺鼎.影响北京体育大学排球方向硕士研究生科研能力的因素研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[24]罗娜.情谊行为侵权责任法律问题研究[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[25]本报记者王小伟.第一批石墨烯标准有望近期公布[N].中国证券报,2013-12-19A11.
[26]罗晓娟.乐山电业局车辆管理系统的设计与运用[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[27]赵若愚.毛泽东群众办报思想研究（1919-1949）[D].河北大学,新闻学,2014,硕士.
[28]王春辉.我国煤炭市场交易决策仿真系统设计与实现[D].中国矿业大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[29]李正颖.我国上市公司股权结构与社会责任信息披露的研究[D].西南大学,会计学,2013,硕士.
[30]刘坤.高速跳频通信系统抗干扰性能研究与仿真分析[D].杭州电子科技大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[31]王洪时.数学方法在机载激光雷达数据处理中的应用[D].吉林大学,运筹学与控制论,2013,硕士.
[32]陈苾铃.我国刑事再审制度的检讨与完善[D].南昌大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[33]江爱桂.人肺腺癌干细胞的分离、培养与鉴定及PI3K/AKT信号传导通路对其增殖及自我更新的影响[D].苏州大学,呼吸病学（专业学位）,2013,博士.
[34]权兵,唐丽玉,陈崇成,兰樟仁,舒娱琴.虚拟地理环境下的林分生长可视化研究[J].福建林学院学报,2004,03:224-228.
[35]丛立庆.纳米SiO_2的合成及其与硅灰对水泥基材料性能影响的研究[D].广西大学,化学工艺,2004,硕士.
[36]岳天宇.《站在高处看风景》翻译实践报告[D].吉林大学,英语口译,2013,硕士.
[37]杨帆.主体间性视野下的师幼沟通研究[D].华中师范大学,学前教育,2013,硕士.
[38]霍春亭.中国建筑业企业劳动生产率水平分析研究[D].哈尔滨工业大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[39]陈辉.激光焊接关键技术的研究[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[40]赵燕.听觉分辨训练增强成年大鼠听觉方位选择性的分子机制[D].华东师范大学,生理学,2013,硕士.
[41]白蕾.慢性肺部疾病相关性肺高血压—吸入伊洛前列素急性期血流动力学和血氧饱和度变化及其对预后的影响[D].苏州大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[42]江雄飞.火灾对钢拱桥承载力影响及自动报警系统研究[D].重庆交通大学,桥梁与隧道工程,2012,硕士.
[43]袁红玉.1932-1937年中学毕业会考制度研究[D].华中师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[44]彭浇.山水画艺术的地域性表现研究[D].中南民族大学,设计艺术学,2013,硕士.
[45]韩晓哲.基于铁路危险品运输的传感器网络覆盖问题研究[D].北京交通大学,2014.
[46]陈鸣宇.医院信息系统在合理用药管理中的应用研究[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[47]王伟.一种广义预测自适应控制的直接方法[J].自动化学报,1996,03:270-277.
[48]夏珍珍.支持多种设备并存的MiniGUI输入引擎及驱动程序设计[D].华中科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[49]蔡明威.脉冲激光定位系统设计[D].华中师范大学,无线电物理,2014,硕士.
[50]齐玎.接近环境正义：环保团体参与环境公益诉讼问题研究[D].复旦大学,诉讼法学,2012,硕士.